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----------這是2021年九月發表在Nature雜志上關于mRNA疫苗歷史的綜述，讓我們一起了解下mRNA疫苗的歷史點點，原文名稱：The tangled history of mRNA vaccines，作者：Elie Dolgin，翻譯摘自網絡，有部分刪減。
1987年底，羅伯特·馬龍（Robert Malone）進行了一個具有里程碑意義的實驗。他將mRNA鏈與脂肪滴混合，創造出一種大分子混合物，使沐浴在這種遺傳物質混合物中的人類細胞吸收了mRNA，并開始從中產生蛋白質。
Malone當時是加州Salk生物研究所的研究生（Salk Institute for Biological Studies），他意識到這一發現可能在醫學方面具有深遠的意義，隨后記下了一些簽有日期的筆記。他在1988年1月11日寫道，如果細胞可以從傳遞到它們體內的mRNA生成蛋白質，就有可能把RNA當作藥物來治療疾病。同年晚些時候，Malone馬龍的實驗又表明青蛙胚胎能夠吸收這些mRNA。這是第一次有人使用脂肪滴來促進mRNA進入活體。這些實驗也是通向歷史上最重要和最有利可圖的mRNA新冠疫苗的基石。面向全球數億人的基于mRNA的covid-19疫苗，僅2021年的全球銷售額就將超過500億美元。
但成功的道路并不是直通羅馬的平坦大道。Malone的實驗本身也借鑒了其他研究人員的工作，mRNA被認為太不穩定而且昂貴，無法作為藥物或疫苗使用。數十個學術實驗室和公司都致力于作為藥物的想法，努力尋找正確的脂肪和核酸配方-這些正是mRNA疫苗的基石。
今天的mRNA是在馬龍在實驗室工作幾年后發明的，包括化學修飾的RNA和不同類型的脂肪泡將它們送入細胞(見“mRNA新冠狀病毒疫苗內部”)。盡管如此，自稱“mRNA疫苗發明者”的Malone認為他的工作沒有得到足夠的贊揚。“我應該被寫入歷史。”他告訴Nature雜志。
隨著mRNA疫苗的大規模應用，關于誰開創這項技術值得贊揚的爭論正在升溫。事實上，mRNA疫苗技術利用了30多年來數百名研究人員的工作成果。
下面的故事闡明了許多科學發現成為改變生活的創新的方式：可以從中了解到科學創新改變生活的過程可能包括了幾十年的阻礙、否定和潛在利潤的斗爭，但更多的是慷慨、好奇和頑強的毅力、以對抗懷疑和不斷探索的精神。正如亞利桑那大學的發育生物學家Paul Krieg所說的：“這是一個漫長的過程，你永遠不知道哪些步驟會有用。”
mRNA起步：
Malone的實驗并不是突然出現的。早在1978年，科學家們就已經使用被稱為脂質體的脂肪膜結構將mRNA運輸到小鼠和人類細胞中來誘導蛋白質表達。脂質體包裝并保護mRNA，然后與細胞膜融合，將遺傳物質送入細胞。這些實驗本身就建立在多年研究脂質體和mRNA的基礎上；這兩者都是在20世紀60年代被發現的(見“mRNA疫苗的歷史”)。
然而，研究早期，很少有研究人員把mRNA作為一種醫療產品來考慮，主要因為還沒有一種方法能夠在實驗室中制造這種遺傳物質。相反，多數人用它來研究基本的分子過程。大多數科學家從兔子血液、培養的小鼠細胞等來源中重新使用mRNA。
在1984年，Krieg和生物學家Douglas·Melton及分子生物學家Tom·Maniatis和哈佛大學的Michael·Green等人利用從病毒中提取的RNA合成酶等在實驗室得到了具有生物活性的mRNA，這一核心方法至今仍在使用。然后Krieg將實驗室制造的mRNA注射到青蛙的卵子中，證明它的工作原理與真實一樣。Melton和Krieg都認為合成mRNA主要是作為研究基因功能和活性的工具。直到1987年，在Melton發現mRNA可以激活和阻止蛋白生產后，他才幫助成立一家公司探索使用合成RNA阻止靶基因表達治療疾病，但在他的實驗室里仍然沒有人想到疫苗。
一般來說，RNA通常以難以置信的不穩定性而聞名，RNA周圍的一切都需要很謹慎。因此，哈佛大學技術開發辦公室決定不申請RNA合成方法的專利，研究人員只是將試劑交給了一家叫Promega的公司，這是一家實驗室用品公司，作為回報他們得到了少量的版稅和一箱香檳。
專利糾紛：
幾年后，Malone使用哈佛團隊的方法合成了mRNA，但他添加了一種帶正電荷的新型脂質體增強了與帶負電荷的mRNA主鏈結合的能力。這些脂質體是由生物化學家Philip·Felgner開發的。盡管Malone成功地利用脂質體將mRNA傳遞到人類細胞和青蛙胚胎中，但他卻從未獲得博士學位，因為他和Salk的導師Inder·Verma不合。他早在1989年就離開了研究生院，到Vical公司為Felgner工作。在那里，他們和威斯康星大學麥迪遜分校的合作者表明脂質mRNA復合物可以刺激小鼠體內產生蛋白質。
在這以后事情變得混亂起來。1989年3月，Vical和Salk都開始申請專利，不過Salk公司很快就放棄了。1990年，Verma（Malone的導師）加入了Vical公司的咨詢委員會，Malone認為Verma和Vical達成了一項幕后交易，使相關的知識產權落入了Vical手中。Malone只被列為幾個發明人之一，不再從隨后的授權交易中獲得個人利益。因此Malone宣稱他們利用他的思想致富。但Verma和Felgner斷然否認了Malone的指控。Verma表示完全是胡說八道，他說放棄專利申請的決定取決于Salk的技術轉讓辦公室。在1989年8月Malone離開了Vical，理由是他與Felgner在科學判斷和學術貢獻上存在分歧。在進入學術界工作之前，他完成了醫學院的學業，并接受了一年的臨床培訓。在學術界，他試圖繼續研究mRNA疫苗，但難以獲得資金。因此他開始專注于DNA疫苗和傳遞技術。2001年，他開始從事商業和咨詢工作。在過去的幾個月里，他開始公開抨擊mRNA疫苗的安全性，不過正是他的研究才使這種疫苗成為可能。Malone舉例說，疫苗產生的蛋白質會破壞人體細胞，而且疫苗接種的風險超過了好處，但這些說法被其他科學家和衛生官員一再駁斥。
生產制造的一些歷史契機
Malone離開Vical后，Vical在1991年與世界最大的疫苗開發企業之一美國Merck公司簽訂了價值數百萬美元的研究合作。Merck公司的科學家評估了老鼠的mRNA技術想要制造流感疫苗，但后來放棄了這一方法。Merck公司前科學家effrey·Ulmer說是生產成本和可行性讓他們躊躇不前。法國一家名為Transgène的小型生物技術公司的研究人員也有同感。在那里由Pierre· Meulie領導的一個小組與工業界和學術界的伙伴合作，1993年首次證明脂質體中的mRNA可以在小鼠體內引發特定的抗病毒免疫反應。Transgène的研究人員為他們的發明申請了專利，并繼續研究mRNA疫苗。但Meulie估計他需要至少1億美元來優化平臺，他不打算為這樣一個棘手、高風險的項目要那么多錢。因此在Transgène的母公司停止支付維持該專利的費用后，該專利失效了。與Merck公司的研究小組一樣，Meulie的研究小組也將重點轉向了DNA疫苗和其他載體運載系統，最終產生了一些用于獸醫應用的疫苗，例如防止養魚場感染的疫苗。就在上個月，印度監管機構緊急批準了世界上第一個用于人類的DNA疫苗，以幫助預防COVID-19。盡管DNA疫苗在人類身上取得成功的速度很慢，但行業對DNA技術的協同推進對RNA疫苗也有好處，一位叫Ulmer的人說，從生產考慮和監管經驗到序列設計和分子研究，從DNA中學到的許多東西都可以直接應用于RNA，這為RNA的成功提供了基礎。
不斷奮斗
在20世紀90年代和21世紀頭十年的大部分時間里，幾乎所有考慮開發mRNA疫苗的公司都選擇了將資源投資到別處。畢竟傳統觀點認為，mRNA太容易降解，而且生產成本太高。而30年前率先研制出一種自我擴增RNA疫苗的病毒學家Peter·Liljeström說這是一場持續的奮斗。另一位1989年創立第一家專注于RNA的實驗室用品公司Ambion的Matt·Winkler也說RNA很難處理，他曾表示如果當時問是否可以把RNA注射到別人體內來制造疫苗他一定會嘲笑。不過mRNA疫苗在腫瘤學領域受到了更大的歡迎，它被當作一種治療藥物，而不是用來預防疾病。從基因治療師David·Curiel的工作開始，一些科學家和公司都在探索mRNA是否可以用于治療癌癥。他們覺得如果mRNA編碼了癌細胞表達的蛋白質，那么將其注射到體內可能會訓練免疫系統攻擊這些細胞。Curiel已經在老鼠身上取得了一些進展，不過他表示當向Ambion咨詢商業化的機會時，該公司表示看不到該技術的任何經濟潛力。另一位癌癥免疫學家Eli·Gilboa取得了更大的成功他從血液中提取免疫細胞，誘導它們吸收合成編碼腫瘤蛋白的mRNA，然后把這些細胞注射回體內，在那里可以組織免疫系統攻擊潛伏的腫瘤，他也和杜克大學醫學中心的同事們在老鼠身上證明了這一點，這導致了第一家mRNA治療公司于1997年成立。到20世紀90年代末時Gilboa的學術合作伙伴開始人體試驗，他的商業附屬公司也進行了自己的臨床研究。直到幾年前一種晚期候選疫苗在一次大型試驗中失敗前這種方法一直看起來很有希望?，F在它基本上過時了，但是Gilboa的工作產生了重要的影響，它啟發了德國CureVac和BioNTech兩家公司的創始人開始研究mRNA。這兩家公司是目前最大的mRNA公司。CureVac的Ingmar·Hoerr和BioNTech的U?ur ?ahin表示在了解Gilboa所做的事情后，他們也想做同樣的事情，不過要直接將mRNA注入人體?，F在就職于佛羅里達邁阿密大學米勒醫學院的Gilboa說，這是一個雪球效應。
加速啟動
Hoerr是第一個取得成功的人。他2000年在德國Tübingen大學發現直接注射可以引起小鼠的免疫反應。同年，他創建了CureVac。但幾乎沒有科學家或投資者對此感興趣。在一次會議上，Hoerr展示了早期老鼠數據，他說有一個諾獎獲得者堅決否定了他的發現。不過最終隨著的資金慢慢流入他們在幾年后開始了人體測試。該公司當時的首席科學官Steve·Pascolo是第一個研究對象，他給自己注射了mRNA，現在他的腿上仍留有頭部一樣大的白色疤痕，這是皮膚科醫生為分析做穿刺活檢留下的。不久之后，一項更正式的試驗開始了，該試驗涉及針對皮膚癌患者的腫瘤特異性mRNA。?ahin和他的免疫學家妻子Özlem Türeci也在20世紀90年代末開始研究mRNA，但等了比Hoerr更長的時間才創辦了一家公司。他們多年來一直致力于這項技術，獲得了專利、論文和研究經費。2007年他們向投資者推銷了一項商業計劃表示如果成功將是突破性的，他獲得了1.5億美元的種子資金。同一年，一家名為RNARx的mRNA公司獲得了一筆數額更小的資金美國政府向小企業提供的97396美元資助。該公司的創始人、生物化學家Katalin Karikó和免疫學家Drew Weissman當時都在費城的賓夕法尼亞大學工作，他們有了一些現在被認為是關鍵的發現：改變部分mRNA代碼有助于合成mRNA繞過細胞的固有免疫防御。
真知灼見
Karikó在20世紀90年代一直在實驗室辛苦工作，目標是將mRNA轉化到藥物平臺，不過資助機構一直拒絕她的資助申請。1995年在多次被拒絕后，她被要求離開賓夕法尼亞大學或接受降職和減薪。最終她選擇留下來繼續頑強追求改進Malone的方案并設法誘導細胞產生具有治療意義的大而復雜的蛋白質。1997年她開始與Weissman合作，當時Weissman剛剛在賓夕法尼亞大學建立了一個實驗室。他們一起計劃開發一種基于mRNA的艾滋病疫苗。但是當Karikó將mRNA注射到小鼠體內后，引發了大量的炎癥反應。她和Weissman很快就發現了原因：合成的mRNA激發了一系列被稱為Toll樣受體的免疫傳感器，這些受體對病原體發出的危險信號起首要反應。2005年他們報告說重新排列mRNA的核苷酸尿苷上的化學鍵，產生一種類似物“偽尿苷”，似乎可以阻止人體將該mRNA識別為敵人。當時很少有科學家認識到這些修飾過的核苷酸的治療價值。不過科學界很快意識到它們的潛力，2010年9月干細胞生物學家Derrick·Rossi領導的一個團隊描述了如何利用修飾過的mRNA將皮膚細胞轉化為胚胎樣干細胞，然后轉化為收縮的肌肉組織，這一發現引起了轟動。Derrick·Rossi被《時代》雜志評為2010年的重要人物之一。他在劍橋與人共同創立了一家名為Moderna的公司。Moderna曾試圖得到賓夕法尼亞大學為Karikó s和Weissman改良mRNA申請專利的許可。但在未能與RNARx達成協議后，賓夕法尼亞大學選擇了快速支付。2010年2月它授予麥迪遜一家小型實驗室試劑供應商獨家專利權?，F在更名為Cellscript的這家公司只在這筆交易中支付了30萬美元但它將繼續從Moderna和BioNTech獲得數億美元的再授權費，這兩家公司是首批COVID-19 mRNA疫苗的創始者，這兩種疫苗都含有修飾過的mRNA。與此同時，RNARx用掉了80萬美元的小企業撥款，并于2013年停止運營，此時Karikó加入了BioNTech。
真假爭論
Karikó和Weissman的發現是否對mRNA疫苗的成功至關重要，研究人員仍存在爭議。Moderna一直使用修飾過的mRNA，但該行業其他一些人沒有。Shire制藥公司的研究人員推斷，如果添加正確的帽狀結構并去除所有雜質，未經修飾的mRNA同樣有效。Shire公司的研究負責人Michael Heartlein表示這是RNA的質量問題。Shire公司將其mRNA組合出售給了位于劍橋的生物公司Translate，并繼續推進這項技術。盡管Translate的一些人類數據表明其mRNA不會引發不良免疫反應，但其平臺仍有待臨床驗證，他們的COVID-19候選疫苗仍在人類試驗早期。不過法國制藥巨頭Sanofi已經被該技術的前景所說服，2021年8月該公司宣布計劃以32億美元收購Translate。與此同時CureVac也改變mRNA的基因序列以最大限度地減少疫苗中的尿苷含量作為緩解策略。經過20年的努力該公司的狂犬疫苗和COVID-19候選疫苗早期試驗都取得了成功。但6月份的后期試驗數據顯示，CureVac的冠狀病毒候選疫苗的防護性遠遠低于Moderna或BioNTech的疫苗。因此，部分mRNA專家認為“偽尿苷”是該技術的重要組成部分，并表示Karikó和Weissman的發現是值得認可和獎勵的。位于劍橋的合成生物學公司Strand Therapeutics的聯合創始人兼首席執行官Jake Becraft表示，在這方面，真正的贏家是修飾過的RNA。該公司致力于研究基于mRNA的療法。不過不是每個人都這么肯定，我國蘇州阿博根生物科技有限公司首席執行官薄穎表示，有多種因素可能會影響mRNA疫苗的安全性和有效性，mRNA的化學修飾只是其中之一。該公司研發的新冠mRNA疫苗目前處于后期臨床試驗階段，該產品使用未經修飾的mRNA。
脂質突破
說到關鍵技術，許多專家強調了另一項對mRNA疫苗至關重要的創新，一種微小的被稱為脂質納米顆粒(LNPs)脂肪泡，它保護mRNA并將其傳送到細胞中。這項技術來自加拿大溫哥華英屬哥倫比亞大學的一名生物化學家Pieter Cullis的實驗室以及他創立或領導的幾家公司。從20世紀90年代末開始，他們開創了LNPs，用于傳遞抑制基因活性的核酸鏈。其中一種名為patisiran的治療方法已被批準用于治療一種罕見的遺傳病。在基因沉默療法在臨床試驗中展示出希望之后，2012年Cullis的兩家公司開始在基于mRNA藥物中探索LNP傳遞系統。例如，由首席執行官Thomas·Madden領導的溫哥華Acuitas Therapeutics公司，與賓夕法尼亞大學的Weissman集團和幾家mRNA公司建立了合作關系，以測試不同的mRNA LNP配方,其中之一現在可以在BioNTech和CureVac的COVID-19疫苗中找到。Moderna的LNP混合物也沒有什么不同。這些納米粒子是四種脂肪分子的混合物，其中三種有助于結構和穩定性，第四種稱為可電離的脂質的是LNP成功的關鍵。這種物質在實驗室條件下是帶正電的，這與Felgner和Malone在20世紀80年代后期開發的脂質體具有類似的優勢。但是Cullis和他的商業伙伴提出的可電離的脂質在生理條件下，比如在血液中，會轉換成中性電荷，這就限制了對身體的毒性作用。更重要的是，四脂能夠允許產品儲存更長時間，并保持其在體內的穩定性。Ian·MacLachlan說他曾在幾家與cullis相關的企業擔任高管，他說這是他們現在擁有的藥理學的全部內容。到2000年代中期，一種混合和制造這些納米顆粒的新方法被設計出來。它使用了T型接頭裝置，將溶解在酒精中的脂肪與溶解在酸性緩沖液中的核酸結合在一起。當兩種溶液合并時，各組分自發形成了密集的LNPs。事實證明，這是一種比其他方法更可靠的技術?，F在是圣地亞哥Replicate生物科學公司首席開發官的Andrew Geall形容說一旦所有的部分都湊在一起，就終于有了一個可以規?；倪^程。2012年Geall領導了第一個將LNPs與RNA疫苗結合起來的團隊。每個mRNA公司現在都使用這個LNP交付平臺和制造系統的一些變體，不過誰擁有相關的專利仍然是法律糾紛的主題。目前，Moderna正在與總部位于溫哥華的cullis旗下企業Arbutus Biopharma就COVID-19疫苗中發現的LNP技術的所有權問題展開激烈的競爭。
行業誕生
到21世紀后期，已經有幾家大型制藥公司進入了mRNA領域。例如2008年，Novartis和Shire都建立了mRNA研究單位，前者(由Geall領導)專注于疫苗，后者(由Heartlein領導)專注于治療。2012年，美國國防高級研究計劃局決定開始資助行業研究人員研究RNA疫苗和藥物，BioNTech就是在那一年成立的，此外這一決定推動了其他初創企業的加入。Moderna是在這項工作基礎上發展起來的公司之一，到2015年該公司已經籌集了超過10億美元的資金，并承諾能夠利用mRNA誘導體內的細胞制造自己的藥物，從而治療蛋白質缺失或缺陷引起的疾病。當這個計劃受挫時，由首席執行官Stéphane Bancel領導的Moderna選擇優先考慮一個不那么宏大的目標也就是生產疫苗。最初，這讓許多投資者和旁觀者感到失望，因為疫苗平臺似乎沒有那么具有變革性，也沒有那么有利可圖。到2020年初，Moderna已經開發出9種可用于傳染性疾病人體測試的mRNA候選疫苗。但是沒有幾個是非常成功的，其中只有一項進展到更大階段的試驗。但當新冠病毒爆發時，Moderna迅速采取了行動，在病毒基因組序列在網上公布后的幾天內就研制出了原型疫苗。隨后，該公司與美國國家過敏和傳染病研究所(NIAID)合作，在不到10周的時間里進行了小鼠研究和人體試驗，生物科技公司也采取了全員參與的方式。2020年3月該公司與總部位于紐約的制藥公司Pfizer合作，臨床試驗以創紀錄的速度進展，在不到8個月的時間里，完成了從首次人體試驗到緊急批準。有兩種授權疫苗都使用LNPs中改良的mRNA，兩者都含有編碼SARSCoV-2刺突蛋白的序列，該蛋白的形狀更易于誘導保護性免疫。許多專家表示，由NIAID疫苗學家Barney Graham、得克薩斯大學奧斯汀分校結構生物學家Jason McLellan和斯克里普斯大學的Andrew Ward設計的蛋白質調整也是一項值得稱道的貢獻，盡管這是針對冠狀病毒疫苗的，而不是作為一般平臺的mRNA疫苗。說到專利，會發現在關于mRNA發現的榮譽討論中，一些爭議與誰擁有利潤豐厚的專利有關。但是，大部分基礎性知識產權可以追溯到1989年Felgner、Malone和他們在Vical的同事提出的主張以及1990年Liljeström提出的主張。這些文件自發行之日起只有17年的期限，所以現在屬于公共領域。即使是2006年Cellscript申請的Karikó、Weissman專利，也將在未來5年內到期。業內人士表示，盡管公司可以合理地為mRNA的特定序列(如刺突蛋白)或專有的脂質配方申請專利，這可能使在脂質納米顆粒中傳遞mRNA的廣泛要求變得困難。Moderna是mRNA疫苗領域的主導公司，該公司在流感、巨細胞病毒和其他一系列傳染病的臨床試驗中進行了實驗性注射。該公司去年獲得了兩項專利，都涉及mRNA用于生產分泌蛋白的廣泛使用，但多位業內人士認為這可能會具有挑戰性。位于加拿大卡爾加里的mRNA疫苗公司Providence Therapeutics的首席科學官Eric Marcusson說他們不認為有很多東西可以申請專利，當然也不可能強制執行。
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